法医DNA小课堂—— 如何判读Off Ladder？
【2018-10-15】
STR分型是法医领域最常用的个体识别方法之一。凭借GeneMapper的强大功能，我们可以大批量、自动化地解决大部分STR基因座的分型问题。
然而，我们会在少部分样本中观察到无法自动标注的Off-Ladder(OL)。有些时候OL是由于分析软件的误差/错误引起的；还有可能是我们遇到了罕见的基因分型。
我们应该如何处理不同情况中出现的OL问题？
今天，大阅哥给大家分析几种可能出现的OL，希望能帮助小伙伴们对OL有更好的理解，在工作中更顺利地解决它所带来的问题。
任意选取了一份样本，挑选了四个基因座，分别使用默认方法Local Southern和3rd-Order Least Squares来进行分析，结果见表1：
可以看到，在基因座较小的情况下，两种分析方法之间的差异还比较小的；然而到了200~300bp的范围，两种分析方法的差异可达0.5bp以上。
幸运的是，在这一份样本中，两种分析方法都给出了正确的分型，并没有造成OL的出现。但情况不总是如此，请看下面另外一份样本结果：
在这份样本中，默认方法误判的OL可以被另一种分析方法正确识别。
尤其是当我们发现小片段的STR经常出现误判的OL时，我们可以考虑更改分析方法。这是由于当下各家厂商生产的试剂盒中，包含的STR基因座越来越多，使得小片段STR越来越“小”，逼近了内标中的最小边界。
由于Local Southern的原理限制，使得小片段的大小分析可能有误。因此，在ABI的GeneMapper IDX说明中写道：“在使用该公司的MiniSTR试剂盒时，不应使用Local Southern方法。”
当然，这里要提醒大家，实验和分析的很多步骤都会影响最终的结果，分析方法本身只是影响因素之一。不同的分析方法很可能获得相同的分型结果；改变分析方法也不保证能解决小片段出现OL的问题。具体什么时候应该改变这项设置，有兴趣的朋友可以在自己的工作中进行一些尝试和验证。
1. OL在Ladder的范围以外
厂商给定的Ladder无法涵盖整个基因座的范围。
如果出现了极小或极大的OL，超出了Ladder的范围，我们是否可以依据它和离它最近的Ladder之间的距离来计算其分型呢？
恐怕并不一定准确，甚至可能是错误的。
据以色列DNA数据库实验室2012年报道，在对一份样本使用SGM Plus Kit进行检测时出现了一个大的OL等位基因，位于D3S1358区域[1]。通过和附近ladder的对比，认为是等位基因22.2。复核检验使用多种试剂盒，得出了截然不同的多种结论。例如，用PowerPlex ESX17 Kit检测，该信号峰位于TH01基因座范围内；而在NGM Kit中，该信号峰则被标记为D1S1656 等位基因9。
最终测序的结果表明，这一未知基因为D3S1358 等位基因22。这一报道提示我们，在超出ladder范围信号的判断中，直接依据相邻ladder的计算是可能出现问题的。这也与我们第一部分的讨论有所联系，即CE平台分型给出的片段大小实际上是个相对值。没有两侧Ladder做标定，我们是无法使用片段大小的数值做绝对定量计算的。
Dr.Butler在其著作中建议：将上述OL标定为>22更为合适，而非通过简单计算认为是22.2[2]。当然，对OL进行测序验证将是最为准确的一种判断方式，但显著地增加了时间和成本。
2. OL在两个基因座之间
这一情况是指：OL出现在两个基因座中间，且不在任意一方的Ladder范围内。选择不同的试剂盒进行检验是个好主意。
在客户的实际案例中，一个稀有的OL基因坐落于D3S1358和D1S1656中间，这一信号峰超出了相邻两基因座的ladder范围。
使用阅微基因MicroreaderTM 23sp ID System 做复核检验，发现这一OL基因属于D1S1656，通过对比计算为等位基因7。进一步的测序也证实了这一判断。
而Dr.Butler在著作中还给出了一些其它的分辨建议：如根据两个基因座的杂合性信息，认为OL属于杂合性高的一方等等[2]，但这些方法是无法确认OL的“归属问题”的。
如果其它试剂盒也无法分辨，或产生了矛盾的结果，最终还是需要对OL两侧的两个基因座进行测序，以给出最终的确认。
如果您工作中遇到超出ladder范围的问题，欢迎联系我们的技术支持，拨打OL热线13391963439，我们将协助您验证。此外，阅微基因可以提供基因测序验证服务，助您准确判断疑难OL的真实分型。阅微基因将竭力协助客户对于疑难检材和案件的处理，为客户提供专业技术协助和整体解决方案。
Reference：
1. Raziel A, et al. (2012). Discordance at D3S1358 locus involving SGN PlusTM and the European new generation multiplex kits. Forensic Science International Genetics, 6: 108-112. DOI:10.1016/j.fsigen.2011.03.010
2. (美)JM. Butler著. 法医DNA分型专论：证据解释. 侯一平，李成涛，严江伟主译. 北京： 科学出版社，2018.1. P51~52
然而，我们会在少部分样本中观察到无法自动标注的Off-Ladder(OL)。有些时候OL是由于分析软件的误差/错误引起的；还有可能是我们遇到了罕见的基因分型。
我们应该如何处理不同情况中出现的OL问题？
今天，大阅哥给大家分析几种可能出现的OL，希望能帮助小伙伴们对OL有更好的理解，在工作中更顺利地解决它所带来的问题。
01 分析方法引起的误差
任意选取了一份样本，挑选了四个基因座，分别使用默认方法Local Southern和3rd-Order Least Squares来进行分析，结果见表1：
表1 使用两种分析方法，结果中分型大小的差异
可以看到，在基因座较小的情况下，两种分析方法之间的差异还比较小的；然而到了200~300bp的范围，两种分析方法的差异可达0.5bp以上。
幸运的是，在这一份样本中，两种分析方法都给出了正确的分型，并没有造成OL的出现。但情况不总是如此，请看下面另外一份样本结果：
图1 使用Local Southern进行分析
图2 使用3rd-Order Least Squares进行分析
在这份样本中，默认方法误判的OL可以被另一种分析方法正确识别。
尤其是当我们发现小片段的STR经常出现误判的OL时，我们可以考虑更改分析方法。这是由于当下各家厂商生产的试剂盒中，包含的STR基因座越来越多，使得小片段STR越来越“小”，逼近了内标中的最小边界。
由于Local Southern的原理限制，使得小片段的大小分析可能有误。因此，在ABI的GeneMapper IDX说明中写道：“在使用该公司的MiniSTR试剂盒时，不应使用Local Southern方法。”
图3 GeneMapper IDX说明书的提示
当然，这里要提醒大家，实验和分析的很多步骤都会影响最终的结果，分析方法本身只是影响因素之一。不同的分析方法很可能获得相同的分型结果；改变分析方法也不保证能解决小片段出现OL的问题。具体什么时候应该改变这项设置，有兴趣的朋友可以在自己的工作中进行一些尝试和验证。
02 罕见等位基因引起的OL
1. OL在Ladder的范围以外
厂商给定的Ladder无法涵盖整个基因座的范围。
如果出现了极小或极大的OL，超出了Ladder的范围，我们是否可以依据它和离它最近的Ladder之间的距离来计算其分型呢？
恐怕并不一定准确，甚至可能是错误的。
据以色列DNA数据库实验室2012年报道，在对一份样本使用SGM Plus Kit进行检测时出现了一个大的OL等位基因，位于D3S1358区域[1]。通过和附近ladder的对比，认为是等位基因22.2。复核检验使用多种试剂盒，得出了截然不同的多种结论。例如，用PowerPlex ESX17 Kit检测，该信号峰位于TH01基因座范围内；而在NGM Kit中，该信号峰则被标记为D1S1656 等位基因9。
最终测序的结果表明，这一未知基因为D3S1358 等位基因22。这一报道提示我们，在超出ladder范围信号的判断中，直接依据相邻ladder的计算是可能出现问题的。这也与我们第一部分的讨论有所联系，即CE平台分型给出的片段大小实际上是个相对值。没有两侧Ladder做标定，我们是无法使用片段大小的数值做绝对定量计算的。
Dr.Butler在其著作中建议：将上述OL标定为>22更为合适，而非通过简单计算认为是22.2[2]。当然，对OL进行测序验证将是最为准确的一种判断方式，但显著地增加了时间和成本。
2. OL在两个基因座之间
这一情况是指：OL出现在两个基因座中间，且不在任意一方的Ladder范围内。选择不同的试剂盒进行检验是个好主意。
在客户的实际案例中，一个稀有的OL基因坐落于D3S1358和D1S1656中间，这一信号峰超出了相邻两基因座的ladder范围。
使用阅微基因MicroreaderTM 23sp ID System 做复核检验，发现这一OL基因属于D1S1656，通过对比计算为等位基因7。进一步的测序也证实了这一判断。
而Dr.Butler在著作中还给出了一些其它的分辨建议：如根据两个基因座的杂合性信息，认为OL属于杂合性高的一方等等[2]，但这些方法是无法确认OL的“归属问题”的。
如果其它试剂盒也无法分辨，或产生了矛盾的结果，最终还是需要对OL两侧的两个基因座进行测序，以给出最终的确认。
如果您工作中遇到超出ladder范围的问题，欢迎联系我们的技术支持，拨打OL热线13391963439，我们将协助您验证。此外，阅微基因可以提供基因测序验证服务，助您准确判断疑难OL的真实分型。阅微基因将竭力协助客户对于疑难检材和案件的处理，为客户提供专业技术协助和整体解决方案。
Reference：
1. Raziel A, et al. (2012). Discordance at D3S1358 locus involving SGN PlusTM and the European new generation multiplex kits. Forensic Science International Genetics, 6: 108-112. DOI:10.1016/j.fsigen.2011.03.010
2. (美)JM. Butler著. 法医DNA分型专论：证据解释. 侯一平，李成涛，严江伟主译. 北京： 科学出版社，2018.1. P51~52
