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5步走——10x单细胞测序细胞悬液制备详解

【2019-08-09】
想做10x单细胞测序,需要制备合格的细胞悬液
· 没有细胞悬液制备的经验?不知道如何开始?
· 不知道什么样的细胞悬液才能满足建库要求?
· 不知道如何进行实验条件优化?
· 不知道在制备细胞悬液的过程中有什么要注意的事项,避开什么坑?

       来来来,跟着大阅哥走,问题全解决。
       如果您对您的样本非常了解,那也不要忘了看看最后的注意事项哦。


  如何制备单细胞测序细胞悬液?  
       对于细胞悬液制备没有经验,那就请按照以下的五步走啦:
第一步:从官网查看10x Genomics单细胞悬液制备官方建议
第二步:利用关键词查询与自己样本类型相同的已发表的单细胞测序文献
第三步:参考知名protocol分享网站,选择适合自己的protocol
第四步:选用单细胞悬液制备或细胞分选的商业试剂盒
第五步:参考悬液制备和质控中的注意事项

       下面,让我们详细看看每个步骤吧。

第一步【10x Genomics单细胞悬液制备官方建议】 
       首先,10x Genomics官网上已有制备部分样本单细胞悬液的官方建议,每个建议都有相关案例解析。当您需要制备单细胞悬液时,第一步当然是先查看官方建议中是否有和自己要处理的样本一样的protocol,如果有的话,就可以直接拿来用,阅微基因已经帮您翻译整理了官方给出的12个建议,欢迎索取~

10x Genomics单细胞官方建议:
Cell surface protein labeling for single cell RNA sequencing protocols
Dissociation of mouse embryonic neural tissue for single cell RNA sequencing
Enrichment of CD3+ T Cell from dissociated tissues for single cell RNA sequencing and immune repertoire profiling
Fresh frozen human peripheral blood mononuclear cells for single cell RNA sequencing
Fresh frozen human-mouse cell line mixtures for single cell RNA sequencing
Isolation of nuclei for single cell RNA sequencing
Moss protoplast suspension for single cell RNA sequencing
Removal of Dead cells from single cell suspensions for single cell RNA sequencing
Single cell gene expression demonstrated protocol compatibility table
Single cell protocols-cell preparation guide
Single cell suspensions from cultured cell lines for single cell RNA sequencing
Tumor dissociation for single cell RNA sequencing

阅微基因根据10x官方建议总结出的单细胞悬液样本制备建议:



       如果官方建议中没有适合的参考方案,那咱们就看第二步!

第二步【相关单细胞测序文献报道】 
       当我们遗憾地发现在官方建议中没有适合自己细胞悬液制备的protocol时,就需要走到第二步啦。现如今已发表的使用10x单细胞技术的文章已经有很多了,且大部分影响因子较高。针对人类和小鼠的大部分组织样本基本上已有相关文献,其中甚至有一些研究专注于组织解离条件优化。所以我们可以上网搜搜和自己相同样本类型的文献,参考其解离方法及高分文章的研究思路。

       阅微基因贴心的帮您总结好了超150篇最新最全的10x单细胞测序发表的相关文献,并按照研究方向归类,快向我们索要吧(详询4000-192-196)。

阅微基因总结的部分文章(参考文献请查看文末)


       其中,2018年发表于《Nature Protocols》的文章“Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies”提供了单细胞转录组的常规研究实验设计指南。让我们先来看看这篇文章在样本处理和单细胞悬液制备上给出了哪些建议。

  • 样本采集:
1.首先,建议采用无菌样品处理方式,包括使用不含核酸酶的试剂和耗材。
2.为减少对细胞的损伤,移液和离心应保持在最低程度。在给定的离心速度、时间和温度下,细胞浓度和大小直接影响制备的效率。紧密堆积的细胞沉淀可能需要额外的操作,但可能也因此会通过剪切效应损害细胞。当然,在这个时候就需要调整离心条件。
3.此外,在进行细胞清洗和重悬过程中,使用具有足够容积的器皿也可避免高浓度导致细胞集聚和结块。

  • 单细胞悬液制备:
1.实体组织需要在一开始进行机械分离或酶消化处理。首先,组织需要通过物理切割或刀片切碎,然后通过酶消化来分离细胞。特定的组织消化酶及消化时间需要仔细选择。
2.样本准备过程可能会引起细胞中基因表达模式的改变,特别是一些胁迫相关基因的激活。此外,一些敏感的细胞亚型可能在此过程中受到伤害。所以,样本准备过程越短越好。相反,如果消化时间太短,可能导致细胞分离不完全,需要在后续单细胞分析过程中排除掉这些紧密相连的细胞。
3.在细胞解离的过程中加入DNase I可以防止细胞团块的形成。
 
第三步【参考知名protocol网站中的方法】 

       查找文献难度大,选择文章决定难?
       找不到适合自己组织样本解离的相似文章?
 
       不要急,我们接下来走到第三步。国外有很多专门供大家查看protocol的网站,上面有大量关于不同组织解离成单细胞悬液的资料。很多都是直接链接到相关文章,其中的protocol也已经被提取好呈现出来了,简直不要太爽。
       例如,大阅哥在知名的protocol分享网站“protocol.io”上以“tumor tissue dissociation single cell”为关键词进行搜索,有高达579条的结果呈现。老师们快去探宝吧!当然,“CSH protocols”是冷泉港实验室分享protocol的网站,内容也非常丰富哦。





第四步【商业试剂盒选择与官网上建议】 
       找到了protocol,需要进行预实验或实验优化。当然,酶在组织消化当中是非常重要的试剂。不同组织类型选择什么样的酶呢?可以去Worthington的官网查看不同组织所用酶表,提供了高达30余种不同组织样本最适酶的方案。
  • Worthington(酶与生化制品的公司)


       同时,上面提到的Nature Protocol[13]的文章中也有提到不同样本最适酶的选择。



       不想去找protocols,或者找到了protocol,里面的一些试剂和组分还需要现买,太麻烦。

       有没有专门的试剂盒来进行组织消解呢?
       当然是有的啦。

       首选10x Genomics官方推荐的试剂盒品牌“Miltenyi 美天旎”,他家有多款商业试剂盒,可以进行组织解离和细胞分选。
阅微基因总结美天旎组织消解试剂盒名称与规格


第五步【注意事项】 

       相信通过前四个步骤,我们一定能够成功地找到适合自己样本的单细胞悬液制备方法。但是我们的五步法还没有结束哦,还有最后一步,这一步就是通用的注意事项。这些经验是阅微基因在处理不同样本时积累下来的经验,大家一定不能错过,快快拿出小本本进行记录吧。

  • 制备细胞悬液篇
1.在拿到一个心仪的protocol后,如果在这之前没有对自己的细胞解离过,那么一定要先进行一下预实验,优化实验条件,得到一个真正适合样本、能够达到建库标准的protocol。在进行预实验的时候,需要考虑到的因素包括样本组织类型、样本来源、是否进行过基因编辑、解离时使用的培养基、选用何种酶、酶的浓度、解离时候的温度和解离时间等。这些都需要提前确认好,这样才能在真正建库时有十分的把握。
2.新鲜的组织最好可以立即解离,比如刚刚下手术的组织。如果太长时间没有解离完成的话,细胞会出现死亡,进而大大降低细胞活性,影响建库效率。如果需要对组织进行保存的话,我们建议将拿到的组织立即放进组织保存液当中,然后放到4℃保存。从拿到组织到最终解离完成,最好不要超过36小时。
3.根据细胞直径大小的不同,需要离心的时间和速度也是不同的。一般来说,直径较大的细胞选用室温150rcf离心3min,直径较小的选用300rcf离心5min。
4.最好可以使用宽枪头重悬,从而减少细胞损伤。窄枪头剧烈的重悬会显著影响细胞活性,同时让细胞破裂,释放RNA。释放的RNA在Illumina上机扩增放大时会影响数据。
5.建议使用含有0.04% BSA (bovine serum albumin)(400 μg/ml)的 1x PBS 溶液 (无 Ca2+、Mg2+) 重悬细胞。BSA的作用是防止细胞结团,若细胞结团可适当提升BSA浓度,但最高不超过2%。
6.原代细胞和干细胞这种比较敏感的细胞类型可能需要额外的溶液或培养基。已确定以下溶液对人 293T/17和小鼠 NIH/3T3细胞系的10x单细胞操作无影响:
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)
如果在上述溶液中不能维持细胞活力,可以用常见的细胞培养基洗涤重悬细胞。以下培养基已确定对人293T/17和小鼠NIH/3T3细胞系的10x单细胞操作无影响:
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) + 10% FBS
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% FBS
Iscove's Modified Eagle Medium (IMEM) + 10% FBS
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) + 10% FBS
Ham's F12 + 10% FBS
1:1 DME M/F12 +10% FBS
M199
7.细胞计数需要设置2个重复,每个样本计数2次,共计数4次。第一次悬液混匀后计数,第二次是再混匀后再计数。
8.另一个需要考虑的因素是不同类型的细胞在RNA含量上相距甚远,而准确测定此参数将影响一些关键决定,比如文库制备过程中的PCR循环数。举个例子,人外周血单核细胞(PBMC)的RNA含量极低,只有0.75 pg/细胞,而HCC38细胞系则富含RNA,含量达到21.6 pg/细胞。
 
  • 细胞质控篇
1.制备悬液时间最好不超过4h。
2.单细胞的悬液中不能含有Ca2+和Mg2+,且不能含有诸如Tween 80之类的表面活性剂,否则会影响细胞活性。
3.视情况选择合适尺寸的细胞筛。细胞尺寸可选20~40μm不等,,目的是滤掉杂质和细胞团。
4.推荐细胞活率为90%以上,低于80%不能上机。
5.细胞悬液的最适浓度:700~1200cells/μL。浓度过高,上样体积太小,误差太大;浓度太低,体积太大,会带入一些杂质和细胞团等。
6.细胞悬液制备完成后要尽快建库,样本制备好到上机的时间间隔不宜超30min。不能保证同时制备多个样本的细胞悬液时,可能导致各样本之间悬液制备间隔时间过长,此时则不建议一次完成多样本建库。
7.最佳上样体积为2.5~15μL,建议上样前根据需要上样的细胞数调整单细胞悬液浓度。
 
       以上呢,就是阅微基因提供给您的完整的5步法制备合格的单细胞悬液。当然了,所有的方法都需要您根据自己的样本类型进行预实验优化,切记照搬有风险,使用要谨慎,预实验非常有必要!

彩蛋第六步【阅微基因直接来帮您】 
       实验室不具备解离组织的条件?实在没有精力和时间去寻找合适的Protocol?预实验总是不成功?别担心,彩蛋第六步——阅微基因帮您直接进行样本解离。请参考下图选择阅微基因的服务吧!



参考文献:
[1] Wang, Yuhan, et al. "Long-term correction of diabetes in mice by in vivo reprogramming of pancreatic ducts." Molecular Therapy 26.5 (2018): 1327-1342.
[2] Cochain C, Vafadarnejad E, Arampatzi P, et al. Cochain, Clément, et al. "Single-cell RNA-seq reveals the transcriptional landscape and heterogeneity of aortic macrophages in murine atherosclerosis." Circulation research 122.12 (2018): 1661-1674. 
[3] Mayer, Christian, et al. "Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons." Nature 555.7697 (2018): 457.
[4] Zemmour, David, et al. "Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR." Nature immunology 19.3 (2018): 291. 
[5] Müller, Sören, et al. "Single-cell profiling of human gliomas reveals macrophage ontogeny as a basis for regional differences in macrophage activation in the tumor microenvironment." Genome biology 18.1 (2017): 234.
[6] Zheng, Grace XY, et al. "Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells." Nature communications 8 (2017): 14049.
[7] Cohen, Merav, et al. "Lung single-cell signaling interaction map reveals basophil role in macrophage imprinting." Cell 175.4 (2018): 1031-1044. 
[8] MacParland, Sonya A., et al. "Single cell RNA sequencing of human liver reveals distinct intrahepatic macrophage populations." Nature communications 9.1 (2018): 4383. 
[9] Miller, Brian C., et al. "Subsets of exhausted CD8+ T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade." Nature immunology 20.3 (2019): 326. 
[10] Sohni, Abhishek, et al. "The neonatal and adult human testis defined at the single-cell level." Cell reports 26.6 (2019): 1501-1517. 
[11] Young, Matthew D., et al. "Single-cell transcriptomes from human kidneys reveal the cellular identity of renal tumors." Science 361.6402 (2018): 594-599.
[12] Ryu, Kook Hui, et al. "Single-cell RNA sequencing resolves molecular relationships among individual plant cells." Plant physiology 179.4 (2019): 1444-1456.

[10] Lafzi, Atefeh, et al. "Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies." Nature protocols (2018): 1.



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