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2022全国病理技术会议:如何选择MMR与MSI检测策略?如何做到MSI规范化检测?

【2023-03-22】

        2023年3月16-18日,2022年全国病理技术会议于广州盛大召开。会议邀请国内知名专家学者围绕常规组织处理与切片制备、特殊染色与组织化学技术、免疫组化技术及新进展、分子病理技术、病理技术质量控制、实验室信息化建设与管理等内容进行专题发言和讨论。

        病理技术的发展给患者带来了全新的治疗希望。分子病理诊断可为肿瘤患者提供精准治疗依据,而精准的分子病理诊断依赖规范化的分子病理检测与解读。本次会议期间,南方医科大学南方医院病理科李红老师围绕微卫星不稳定(MSI)/错配修复(MMR)检测方法及质控要点做了详尽介绍。



南方医科大学南方医院病理科李红老师

01 MMR免疫组化检测的挑战,如何选择MMR与MSI检测策略?
        李红老师:在解释MMR染色结果时,美国病理学会(CAP)建议肿瘤细胞核内任何阳性反应均被认为是完整表达(正常)。理想情况下,MMR表达呈弥漫阳性,而且染色强度相当于甚至高于自身内对照细胞。但是,由于肿瘤的异质性、组织固定、染色技术、抗体质量和新辅助放化疗等因素的干扰,可能会出现异常的染色情况,导致结果误判。如将弱染色/局灶染色、点状染色、背景染色判为正常表达。MMR检测严格的质控除了严格的实验与判读环节,还应建议使用MSI和MMR同时检测。

        总体上,研究表明,约10%的CRC患者存在MSI-PCR和MMR-IHC检测结果不一致的情况,从而会对患者治疗选择产生影响。

        dMMR/MSS的可能原因:MMR系统存在功能补偿,使MSS状态不变,常见的补偿机制为PMS2和PMS1互补,MSH6和MSH3互补;新辅助治疗导致的MSH6表达缺失或PMS2表达较弱;MLH1启动子甲基化可解释多数MLH1蛋白缺失但MSS的现象。

        pMMR/MSI-H的可能原因:MMR系统除了4个检测蛋白外,IHC未检测的MMR基因突变或尚未识别的MMR基因突变可能导致MMR缺陷,表现为MSI-H;MMR基因发生错义突变时,MMR蛋白功能出现异常但仍保留抗原性;MMR蛋白异质性表达,MMR蛋白表达缺失的区域也可能存在MMR基因突变及MLH1的甲基化,表现为MSI-H。MMR的异质性表达并非技术原因引起的染色不均匀,MLH1启动子的异质性甲基化、可变的表位表达、MSH6的次级不稳定、肿瘤分化等都是异质性表达的可能原因。
        2019年ESMO指南指出由于MMR或MSI结果的假阴性/假阳性,使近10%的mCRC患者对免疫治疗原发抵抗。因此,指南建议MMR-IHC和MSI-PCR联合检测,评估Lynch综合征谱系癌症患者接受PD-1/PD-L1治疗的资格。2022年CAP指南亦指出如果出现了不一致结果,病理学家应将IHC证实的dMMR或者PCR/NGS证实的MSI-H均解释为阳性结果,从而使患者有资格接受免疫治疗。此外,MMR的亚克隆缺失区域应进行MSI-PCR验证。


02 如何做到MSI的规范化检测?

        李红老师:目前MSI检测方法包括荧光PCR-毛细管电泳法以及NGS法,检测位点涉及单核苷酸重复位点及双核苷酸重复位点。《结直肠癌及其他相关实体瘤微卫星不稳定性检测中国专家共识》明确指出PCR毛细管电泳法是MSI检测的“金标准”,基于 PCR法中的Pentaplex panel的5~7个标志位点组合 BAT25、BAT26、NR21、NR22、NR24、NR27和 MONO27被认定为 PCR MSI检测的“金标准”。同时,NCCN、ESMO也联合推荐敏感性与特异性更佳的单核苷酸检测位点。美国病理学会CAP发布的MSI室间质评数据显示,2012年选择单核苷酸位点的实验室超过70%。我国自主研发的6个单核苷酸检测Panel(Bat 25,Bat 26,NR 21,NR 24,NR 27,MONO 27),在MSI检测过程中,为防止扩增产物污染,使用了UDG酶防污染体系、为避免样本间相互污染和样本混杂,设置了包括性别位点和个体识别位点在内的两类质控位点、在每一次MSI检测时使用分子量内标、并同时检测同一个患者的的正常对照组织,多重质控,保证了MSI检测结果的准确性。注册遵从《MSI检测试剂临床试验注册审查指导原则》,经过国内3家顶级肿瘤医院1000多例的临床数据验证,与MMR-IHC伴随诊断产品相比总符合率达97.25%。


        NGS检测MSI的基本原理是:通过刻画选取的MSI位点不同重复序列长度对应的reads数在MSI-H和MSS中的差异来判断位点的不稳定状态 ,以不稳定位点比例是否超过既定阈值来确定样本的MSI 状态。MSI检测的主流算法包括mSINGS、Misensor和MANTIS等,不同阈值、用于分析的微卫星位点的数量以及检测癌种均会影响算法检测的准确性。国内尚无NMPA批准的用于MSI检测的NGS panel,且MSI位点选择,标准算法等均未统一。2022年CAP指南指出结肠癌、胃食管癌、小肠癌患者,在使用PD-1/PD-L1抑制剂时优先使用MMR-IHC/MSI-PCR,而不是NGS。NGS虽具有可同时捕获多段基因组序列、提高分子诊断效率、降低样本用量的优点,但是同样面临着检测技术复杂、不易标准化、需要大样本的验证以及价格昂贵的不足。



        随着药物研发获批进度的加快,全球已有6种PD-1/PD-L1抑制剂获批用于MSI-H/dMMR的晚期实体瘤患者,MSI的规范化检测可以精准指导患者免疫治疗获益、预测化疗疗效、判断预后、辅助林奇综合征的筛查,具有十分重要的临床应用价值。

 专家信息 


李 红  老师

        南方医科大学南方医院病理科主管技师,广东省基层医药学会细胞病理与分子病理专业委员会委员、从事结直肠癌、肺癌等肿瘤发生及转移相关分子机制的研究,先后以第一作者身份发表科研论文多篇。



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