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法医领域
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光谱校正指导
以Applied Biosystems 3500/3500XL遗传分析仪为例:
(一)光谱校正试剂的准备
1、 根据仪器的灵敏度确定光谱校正试剂的加入量,一般为2~4 μl,加入
196~198 μl去离子甲酰胺使体系达到200 μl,混匀;
2、 对于3500XL遗传分析仪,分装到96孔PCR板的A1-H3孔中,对于3500遗传分析仪,分装到A1-H1孔中,均不能分装到其他孔。每孔分装10 μl;盖上隔片,短暂离心。
3、 95℃变性3 min,立即放在冰上冷却3 min;
4、 将PCR板置于3500 96孔标准底座上,盖上板盖。放在自动上样器A板的位置。
(二)仪器参数设置和运行
根据3500/3500xL型遗传分析仪的用户手册,进行仪器保养维护、 安装毛细管矩阵、更换缓冲液及胶,并进行空间校正。详细可参考 3500/3500xL型遗传分析仪的用户手册。
1、 打开3500 Data Collection software,右侧Pre-Heat the Oven下温度设 置为60℃,在第一次电泳之前,点击Start Pre-Heat icon至少预热仪器 30mins。(下图)
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3、 在出现的 Create New Dye Set 界面中,Dye Set Name 命名为 MR E5; Chemistry 选择 Matrix Standard;Dye Set Template 选择 E5 Template。 点右下角 Save 保存设置。
4、 点菜单栏 Maintenance,左侧导航栏点 Spectral;出现的 Calibration Run 界面中,Chemistry Standard 选择 Matrix Standard,Dye Set 选择 MR E5;其他设置不变。
5、 点右侧 Start Run 开始运行。
6、 如果第一次校正通过的毛细管数少于规定值,仪器会自动重复运行 光谱校正两次。在光谱校正完成后,仔细检查每根毛细管的峰图 ,确 保无误后点 Accept。
对于详细的光谱校正 质量判断标准参照 3500 Series Data Collection Software Version 1.0 HID User Manual
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光谱校正不通过
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内标不通过
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没有产物峰或产物峰很低
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产物峰高
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扩增不当导致杂峰
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仪器运行导致伪峰
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产物峰宽
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产物峰失衡
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大部分产物峰OL
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小片段峰正常,大片段峰OL
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个别基因座OL
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前高后低的双肩峰
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