阅微基因动物STR分型试剂盒正式成团，出道！
【2022-07-21】
STR（short tandem repeat，短片段重复序列，也称作SSR）分析的方法出现在上世纪八十年代末，它的科学基础来自八十年代的两个分子生物学进展——PCR扩增技术和DNA上STR序列的发现。近年来，DNA技术在繁育新品种、保障食品质量安全和打击违法犯罪等方面有着广泛的研究和应用，那么，在个体识别和亲缘鉴定界有着“绝对领导力”的STR检测是如何工作的呢？
多态性无可匹敌的STR
STR广泛存在于人类及哺乳动物的基因组中，具有个体间高度多态性，一般由2~6个碱基构成一核心序列，核心序列串联重复排列，对于某个特定个体，染色体上特定位置的重复序列其重复次数是固定的，而不同个体在同一位置的重复次数可能不同，这就构成了这些重复序列的多态性（由核心序列重复数目的变化产生长度多态性）。由于基因组中这种重复序列非常多，且又符合遗传定律，因此通过对这种多态性的检测，就可以明确区分动物个体进行个体识别、鉴定亲缘关系。
此外，STR可用于构建遗传图谱、遗传标记选择、建立DNA指纹用于品种鉴定，或是利用标记辅助选择加快育种速度等。不仅如此，STR分子标记还可用于基因定位、QTL分析、系谱分析、群体间遗传距离分析、进化和遗传多样性研究等。
阅微基因——STR多重扩增试剂盒的执舵手
阅微基因自成立至今十余年，始终致力投入STR项目的研发及商业化。成果包含法庭科学常/性染色体等DNA扩增试剂盒十余款。在动植物科研方面，自2012年起至今承接物种项目数百件，覆盖包含有参及无参等逾百物种的引物设计开发、多态性检测及遗传分析。至2017年，首款非人源STR试剂盒——小鼠STR分型试剂盒上市并应用于生物制品产业的细胞鉴定工作。此后，阅微基因陆续开展了猴Vero细胞、牛、马、猫、犬、鸽等物种STR分型试剂盒的研发及生产工作，也是国内创新提供商业化动物STR分型试剂盒的厂家。
在种质资源日益受重视的今日，阅微基因也忝受国内农林/种质资源领头单位委托，合作进行作物品种国标分子检测，兰花、枸杞等地方特产植物的基因身份证及遗传距离分析项目，目前阅微基因STR项目的年检测样本数已近万例。
图1 阅微基因动物STR分型试剂盒图谱
试剂盒采用荧光PCR扩增（Quantitive Fluorescent PCR，QF-PCR）结合毛细管电泳检测方法，对国际动物遗传学学会（ISAG，International Society for Animal Genetics）推荐位点进行检测，设置5色荧光，扩增片段控制在500bp以内，拥有全套的样本处理流程，满足血痕、毛囊、唾液棉签等多检材的样本类型，灵敏度可达0.5ng，确保分型结果可靠。
表1阅微基因动物STR试剂盒，物种及对应的常染色体STR位点数
试剂盒开发没想象中简单
虽然STR分子标记的应用行之有年，但开发一款好用的STR商用试剂盒却绝非易事。没有几年功夫沉淀是很难做到的。下面我们来详细说道。
图2 阅微基因STR多重扩增试剂盒开发的项目流程
首先是需要筛选出多态性良好的位点。动植物的流通性不比人群，不同的品系或地区种群的多态性位点很可能不同。所以筛选出一套多态性高的位点组合往往需要时间与大量样本的积累。所幸在动物遗传方面，ISAG已经提前做了详尽工作，邀集多国实验室收集不同地区物种品系进行位点筛选，提供出一套适用于大部分品系的位点组合。我们通常会参照ISAG的位点建议，并结合国内外文献报告来进行位点筛选，并根据客户实际需求增加位点，而后用批量真实样本进行位点多态性确认。
其次，相较于人源主要使用四碱基基因座[即核心重复单元为4个碱基，比如（ATAG）n]，目前被报告的动物STR基因座多数为二碱基基因座，这也为动物STR分型试剂盒的开发增加了难度。主要是由于DNA聚合酶滑脱的特性，在二碱基重复位点的情况比四碱基重复位点来的更为严重。因此在STR分析时不可避免出现的影子峰（stutter峰，通常出现在主峰即真实序列长度减去整数个重复碱基数）在二碱基位点也会更为明显，更可能影响到结果判读，也更考验研发人员对引物设计及体系均衡性的把控能力。
图3 杂合子stutter峰示意（标记A为主峰，标记B和C为影子峰）
图4 人四碱基位点杂合子，在主峰前也有小的影子峰
图5 牛2碱基位点杂合子的主峰及明显的影子峰
而在动物STR试剂盒开发中，质控品的选择也颇费一番心思。质控品用于开发过程中的试剂盒性能确认，也用于后续试剂盒实际应用中的性能校准。动物不比人类，有国际公认标准品，如法医常用的9947和9948，我们需要为每个物种找到可持续获得、稳定的质控品。一般我们会从国际细胞库采购适用的目标物种细胞作为质控品，而部分没有细胞系的物种，则会尽可能一次获取高量的DNA进行储备，比如您可能会在市场碰见阅微基因的研发人员去采购一大块肉品
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此外，部分动物有高度封闭种群内繁殖的特性，导致位点多态性低于预期，需安排补充位点检测；部分动物由于基因组SNP信息缺乏，在引物设计时无法预先考虑结合区SNP问题导致增加研发周期等，都是阅微基因在动物STR试剂盒开发流程中遇到过并已着手解决的问题。
性能验证是重中之重
试剂盒开发还有一项很重要的工作便是试剂盒性能验证，这也是与科研项目中多采取的单位点检测最大的差异处。阅微基因的试剂盒性能验证包含“扩增体系测、酶体积测试、引物体积测试、退火温度测试、预变性温度、终延伸时间、适用机型测试、种属特异性测试、灵敏度、混合样本”等多达十二项常规验证工作。须达到在不同的反应体系或工作条件下并未出现丢点或明显的失衡问题，才能通过公司项目阶段评审，正式进入小试生产环节。
图6 不同PCR退火温度条件测试结果良好
细致的终极解决方案
为保证客户项目的顺利进行，阅微基因除了试剂盒输出外，还针对客户实际需求提供批量报告自动化软件开发、数据库建设及比对软件开发等配套服务。尽可能朝便捷、稳定、自动化的目标推进，减少人工判读及人工输出，以最大程度地提升可运行性及客户满意度。
阅微基因——专注多基因联检整体解决方案
阅微基因拥有一支理论和实践经验丰富的研发队伍，建立了基于多项技术平台的产品开发能力。在北京拥有现代化研发和检测实验室，研发设备齐全。同时，在北京昌平和江苏医疗器械产业园（苏州高新区）建立了符合ISO9001/14000/13485/18385质量管理认证的万级GMP 生产车间，总面积3000余平方米，对研发成果进行转化、生产和注册申报，是一家集多基因联合检测产品研发、生产和经营为一体的高科技生物公司。
阅微基因的核心技术平台——“中通量荧光PCR-毛细管电泳平台”对中小Panel（5~40位点）检测具有高度优势，搭配不同通量基因分析仪的自动进样功能，日检测样本量最高可达4500份，相当于单日完成22,500~180,000个标记检测；同时对样本质量的要求低，能满足多类型样本上机检测，包含口腔拭子、毛囊、血液、血痕/干血斑、精液等，并支持血痕/干血斑样本免提取直接扩增。产物长度在500bp范围内可实现单碱基分辨率，检测结果下机数据文件导入分析软件，分型结果一目了然，实验结果准确可靠。
阅微基因携丰富的项目管理及研发经验，可根据客户需求进行多重扩增试剂盒定制开发，覆盖分子标记类型包含STR、SNP、InDel、CNV及特异性目标序列片段，且单管反应体系内可兼容多类型分子标记，更大程度地满足客户实际应用需求。
阅微基因动物STR分型试剂盒
