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全转录组联合分析

全转录组联合分析

全转录组,指的是特定细胞在某一状态下所有转录产物的集合,包括了mRNA和非编码RNA,例如lncRNA,miRNA,circRNA等。随着近些年对于非编码RNA研究的不断深入,发现多种非编码RNA(lncRNA , circRNA)可作为竞争性内源RNA(competitive endougenous RNA,ceRNA)参与基因的表达调控,ceRNAs可以通过与mRNA竞争结合miRNA来调节基因转录本的翻译。全转录组分析便是针对一份样品同时分析mRNA,lncRNA,circRNA和miRNA之间的联合调控关系,全面构建精细的RNA调控网络,也能有利于对于ceRNAs—miRNA—mRNA调控机制进行深入挖掘,更好的阐明生物学的相关问题。

全转录组分析的主要目标是了解不同类型转录产物之间的行为和机制,其具有分析内容更加全面,可靠性更高等优点,可广泛应用于免疫机制、疾病领域、发育进化研究、致病机理和药物靶标等研究。

技术路线

全转录组分为研究对象的不同可以分为两种建库方式:

建两个库的模式:

分别建(lncRNA、mRNA、circRNA)的库和建小RNA的库。
建三个库的模式:
分别建(lncRNA、mRNA)的库,小RNA的库和富集的circRNA的库。
技术路线:
针对于不同转录组RNA类型的建库方法可以参考之前的篇章

建2、3个库示意图(注:去rRNA,链特异性建库也可以得到circRNA的信息并进行分析。但是得到的circRNA的数据量和完整性远不如去rRNA及去线性RNA的链特异性建库方法。)

技术优势

测序策略

测序策略:
PE150(针对mRNA,lncRNA,circRNA),SE50(针对miRNA)
建议数据量:

建两个库:常规12G,深度20G以上

(包括mRNA,lncRNA,circRNA一个文库和miRNA文库)


建三个库:常规20G,深度30G以上

(包括mRNA,lncRNA一个文库,circRNA文库和miRNA文库)

收样要求

建两个库:

总RNA
5μg(lncRNA:2μg,sRNA:3μg)
浓度
>200ng/μl
RIN值
>7.5


建三个库:

总RNA
10μg(lncRNA:2μg,sRNA:3μg,circRNA:3μg)
浓度
>200ng/μl
RIN值
>7.5

您可以得到的数据分析

全转录组分析思路示意图


全转录组测序生物信息学分析

分析
全转录组联合分析

标准分析

(常规分析)

测序数据质控

测序数据与数据库比对


mRNA

测序数据质控分析

高质量序列与参考基因组比对

基因表达谱构建

基因的可变剪切分析(真核生物)

基因结构优化及新转录本预测

样本间基因差异表达分析

差异表达基因的KEGG和GO功能分析

SNP、InDel等基因结构变异筛查

链方向性分析


lncRNA

已知mRNA鉴定

mRNA表达谱分析

已知LncRNA鉴定

LncRNA表达谱分析

预测新LncRNA

新LncRNA的功能预测

新LncRNA二级结构预测及表达谱分析

样本间mRNA差异表达分析(有重复样本)

样本间LncRNA差异表达分析(有重复样本)

差异基因的GO分类和KEGG富集分析(有重复样本)


miRNA

小RNA分类及注释(miRNA, siRNA,piRNA, rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, repeat asscociated sRNA等)

预测新的miRNA

miRNA靶基因预测

靶基因功能注释、GO富集分析和代谢通路富集分析

miRNA表达谱分析

样本间miRNA表达差异分析(有重复样本)



circRNA

反向剪切位点定位

circRNA鉴定与注释

circRNA来源基因分析

circRNA表达水平分析

鉴定新的circRNA

样本间差异circRNA表达分析及筛选

差异表达基因的GO和KEGG富集分析

全长环形转录本重建(建三个库)

可变剪切事件识别(建三个库)

两两关联分析

(高级分析)

CircRNA-miRNA关联分析

lncRNA-mRNA关联分析

miRNA-mRNA关联分析

lncRNA-miRNA关联分析

全关联分析

(高级分析)

LncRNA-circRNA-miRNA-mRNA关联分析


案例解析

深度测序解释上皮细胞与间充质细胞转化过程全转录组中lncRNA的全局趋势


很多研究指出了lncRNA在上皮细胞转化为间充质细胞的过程(EMT)中行使了很重要的作用,而这一生物过程与肿瘤的转移紧密相关。本文欲研究lncRNA,mRNA和circRNA组的变化在EMT过程中的调控作用,应用全转录组测序的手段对TGF-β诱导的EMT期间的MCF10A细胞进行研究,结果显示:MCF10A的全转录组成分在被TGF-β诱导后8h发生全面变化,其中包括了3,404个已知与未知的lncRNAs和570个已知与未知的circRNAs发生了变化。为了鉴定关键调控因素,创建了转录组共表达网络,揭示了在EMT过程中lncRNA与mRNA的交互作用网络,发现了网络中重要节点为lncRNA,其中lncRNA RP6-65G23.5最为重要。同时,circRNA的测序数据也为接下来的全基因组学研究提供了基础。本研究揭示了lncRNA在EMT全转录组中的分子机制和调控网络,为后续的EMT研究奠定了基础。


Liao, Jian-You, et al. "Deep sequencing reveals a global reprogramming of lncRNA transcriptome during EMT."Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research(2017).(impact factor:4.95).


A. 全转录组(lncRNA,circRNA)生物信息学分析流程图(左边为lncRNA测序信息分析流程,右边为circRNA测序信息分析流程)

B. lncRNA与mRNA共表达网络图,方形代表mRNA,三角形代表lncRNA,可以看出,网络图的重要节点均为lncRNA(图中红圈标示)。


全转录组层面上对于miR-184及其突变体处理过的晶状体上皮细胞中mRNA/circRNA的探究


小RNA:m-miR-184(miR-184突变类型)与眼部疾病的发生发展密切相关,但是m-miR-184的生物学功能目前尚不明确。本研究通过分别对用miR-184和m-miR-184处理后的眼晶体状上皮细胞和不处理对照组细胞进行转录组测序,鉴定了与m-miR-184相关的新基因和16个显著差异表达的基因,GO富集分析和KEGG代谢通路分析揭示这些基因与膜形成基因和钙离子通路相关,紧接着进一步的验证和分析,对比三组对照组的测序数据,得出了与眼部疾病密切相关的基因LDH5A1 和GABRA3。与此同时,基于环状RNA可充当miRNA分子海绵的思路,本研究也对这三组样本进行环状RNA测序,且对环状RNA的miRNA结合位点和表达模式进行分析。总而言之,本研究通过对于不同处理样本进行转录组测序和环状RNA测序,揭示了m-miR-184在眼部疾病中的重要功能,和相关mRNA/circRNA与之的联系。


Luo, Yueqiu, Siyu Liu, and Ke Yao. "Transcriptome-wide Investigation of mRNA/circRNA in miR-184 and Its r. 57c> u Mutant Type Treatment of Human Lens Epithelial Cells."Molecular Therapy-Nucleic Acids(2017): 71-80. (Impact factor: 6.4)

A.差异表达基因韦恩图,1:miR-184处理样品和对照组差异表达基因;2:m-miR-184处理样品和对照组差异表达基因;3:miR-184处理样品和m-miR-184处理样品差异表达基因;

B.全转录组层面分析得出,m-miR-184可以影响丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路通过对ALDH5A1 和 GABRA3进行负调控,进而导致眼部疾病,同时circRNA可以充当m-miR-184分子海绵。

客户常见问题

全转录组测序分析内容?
针对mRNA、lncRNA、circRNA和miRNA的标准分析和高级分析,还包括不同种RNA之间的互作网络调控分析。

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