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菌种荧光定量

菌种荧光定量

荧光定量PCR技术是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时监控反应过程。随着 PCR 反应的进行,反应产物不断累积,荧光信号强度也等比例增加。如此一来便可通过荧光强度变化监测产物量的变化,结合相应的分析软件,可以得到荧光扩增曲线,计算样本间目标基因初始模板的相对量(相对定量),或通过比对已知拷贝数的标准品,得到待测样本目标基因的初始模板量(绝对定量)。实时荧光定量PCR技术是一次由定性技术向定量技术的飞跃,可实现对DNA、RNA样品进行相对定量、绝对定量和定性分析。
许多研究在开展高通量测序前,都会对目标菌种的存在与否或丰度进行大致的评估。当微生物高通量测序结束,得到物种多样性和样本中菌群结构信息后,也会对结果进行验证。而荧光定量的方法是对菌种丰度定量或鉴定某菌种是否存在的一种重要且常见的方法。

服务项目

运用成熟的实时定量检测技术,结合目标菌种基因序列特点设计特异性引物,保证扩增的特异性和准确性,提供稳定的检测结果。
★ 菌种类型验证
★ 目标菌种存在验证
★ 样本间目标菌种丰度相对定量
★ 菌种丰度绝对定量

技术路线


技术优势


收样标准

土壤:
10 g
粪便:
2-5 g
血液:
10 mL
污泥/沉积物:
总量≥200 ng,浓度≥10ng/μL,
有明显主带,无降解,无RNA蛋白质污染,
OD A260/280:1.8 - 2.2
DNA:
总量≥1 μg,浓度≥20 ng/μL,
OD A260/280:1.8 - 2.0,
有明显主带,无降解

案例解析

牛瘤胃中甲烷短杆菌属的菌种分布影响甲烷产生量


        瑞典农业科学大学的研究团队对21只分别在三个月相同喂养条件下,持续低,中,高甲烷排放量的奶牛(12 只荷斯坦牛和 9 只瑞典红牛)在纤维消化、发酵终产物和瘤胃中细菌、古菌的组成上进行研究。研究方法分为对牛瘤胃中菌群进行16S rDNA V4区测序及对甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)菌群体进行荧光定量分析两部分。结果显示,虽然甲烷短杆菌属在甲烷高、中、低产的牛之间没有显著差异(只有趋势),但该属中的单胞菌种Methanobrevibacter ruminantium如果占比越多,则牛屁中的甲烷含量就越低。

        其16S rRNA扩增子测序的结果,基于序列结果OTU 水平上的主坐标分析 (PCoA) 发现了两个差距较大的簇,分别对应高甲烷产出和低甲烷产出(中等甲烷产生在两个簇里面都存在)。这两个簇的主要区别在于普氏菌属(Prevotella)的丰度不同。此外,和英国科学家的发现一致,低甲烷产出的簇中有较多的序列属于琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae) 家族。研究也进一步讨论了低甲烷产出的奶牛可以更加有效率的利用饲料与牛奶产量(在低甲烷产出中丙酸盐比例较高而高甲烷产生中丁酸盐比例较高),可能源自于微生物群体和优势菌种基因功能的不同。

Danielsson R et al., "Methane production in dairy cows correlates with rumen methanogenic and bacterial community structure" Front. Microbiol (2017) DOI: 10.3389/fmicb.2017.00226


左图代表菌属组成,蓝色为甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter),
右图代表甲烷短杆菌属中的两个分支

常见问题


荧光扩增曲线和熔解曲线的意义分别是什么?

荧光扩增曲线在在荧光信号指数扩增阶段,PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系,荧光阈值(threshold)是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,而每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数被称为Ct值。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
染料法熔解曲线是为了区分反应是否存在非特异性扩增和初始模板有无被污染的情况,如果出现单一峰且峰值在Tm值位置,便说明不存在非特异性扩增且初始模板未被污染;如果出现多个峰,表示存在非特异性扩增或初始模板受污染。TaqMan探针法由于其探针设计特点可以保证所侦测到的荧光信号均来自特异性扩增,因此利用TaqMan探针法进行荧光定量实验的结果中不提供熔解曲线。

蓝色横线表示阈值,而扩增曲线(红色)与阈值交会的点即为该样本的Ct值(又称Cp或Cq值)



目标菌株鉴定或验证需要提供何种序列?

一般来说,会选取目标菌种16S/18S/ITS高变区的特异性序列进行引物设计,序列可以由客户提供,也可以由我们来设计。当然,如果有某种菌株16S/18S/ITS高变区域外的特异性序列,也可作为目标菌种鉴定的引物设计参考序列。

细菌丰度的估计方法大致有2种,一种是计算出样本中目标细菌的绝对基因拷贝数,来反应细菌的绝对数量;另一种是计算目标细菌rRNA基因拷贝数相对于总细菌rRNA基因拷贝数的丰度。


目标菌种的丰度如何检测?
在菌种的绝对定量中,需要建立标准曲线,后可通过采用SYBR Green或TaqMan荧光定量的方法计算拷贝数与Ct值之间的线性关系从而估算菌种丰度。

相对丰度定量方法是考虑16S rRNA基因在细菌中的表达是保守的,因而用基因拷贝数来代表细菌的数目,通过目标菌种与总细菌的初始拷贝数比来推算其在环境样本中的丰度。此方法可在一定程度上调整不同样本来源及不同样本类型之间的差异,尤其是在对不同类型样本进行横向比较时,更具有实际可操作的意义。