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微生物基因组 de novo/重测序

微生物基因组 de novo/重测序

微生物基因组测序,是基于二代测序平台、三代单分子测序平台或联合测序平台,对单一菌株样品基因组进行测序、组装、功能注释和结构比较等工作。根据近缘参考序列信息的有无和测序策略的不同,微生物基因组可以分为de novo测序和重测序两大类。De novo测序通过对细菌或真菌基因组的从头组装,探知其基因组的基因组成、结构元件和功能信息。针对存在近缘参考基因组的变异检测分析,细菌或真菌的重测序可以通过对单核苷酸多态性(SNPs)、插入缺失(Indel)、结构变异(SV)等一系列变异信息的分析,解析其基因组间的性状特征和差异等。

微生物基因组探索也被实际运用在临床和食品工艺领域,临床主要针对具感染或致病性的细菌/真菌进行分析,而食品工艺则关注菌株的耐受性或食用、药用价值等。

应用范围如下:

抗性突变比较研究;不同基因型菌株和机会致病菌研究;变异分析、毒力及耐药基因注释;挖掘关键致病因子;挖掘食用、药用真菌的系统进化分析;菌株耐受性研究

技术路线

技术优势


测序策略


细菌de novo
真菌de novo
细菌重测序
真菌重测序
测序策略:
三代
PacBio Sequel,
10kb文库


三代
PacBio Sequel,
20kb文库,
测序深度100×


二代
Illumina Hiseq
350bp文库,
100×
二代
Illumina Hiseq
350bp文库,
30×
建议数据量:
≥500Mb

取决于基因组大小

收样要求

细菌基因组de novo
DNA总量≥10µg,浓度≥50ng/μL,
OD A260/280、OD A260/230:1.8 - 2.0,
用RNase处理过,无RNA污染
真菌基因组de novo
DNA总量≥10µg,浓度≥50ng/μL,
OD A260/280:1.8 - 2.0,OD A260/230:1.8 - 2.2,
跑胶主带清晰≥23kb,用RNase处理过,无RNA污染
细菌/真菌重测序
DNA总量≥1μg(2次建库量),浓度≥50ng/μL,
OD A260/280、OD A260/230:1.8 - 2.0,
DNA无降解或轻微降解

您可以得到的数据分析

生物信息分析流程


1. "0 Gap”完成图——三代细菌基因组
基于illumina及其他二代测序平台组装得到的细菌基因组往往会存在不少“Gap”,而PacBio测序具有超长读长的优势,能够克服微生物基因组GC异常、高度重复的问题,使细菌完成图成为可能。精确组装的细菌完成图,可为微生物功能基因挖掘、病原菌防控、基因编辑等各领域提供全面准确的数据支持。


2. 三代真菌基因组de novo测序
真菌广泛存在于自然界中,基因组大小一般在2.5Mb-150Mb之间,而其基因组的复杂程度介于大型动植物与细菌之间。真菌基因组学的研究有助于全面了解其生物学功能背后的分子遗传机制,为发酵育种、毒性分析提供数据支持。


3. 微生物(细菌/真菌)基因组重测序

案例解析

利用PacBio三代测序绘制青海弧菌Q67基因组完成图

细菌de novo 基因组测序

淡水发光菌——青海弧菌Q67(Vibrio qinghaiensis sp.-Q67,简称Vqin-Q67)是一种可以持续发出蓝绿色荧光的细菌,由于其对多数化合物有较高的毒性敏感性,被广泛地应用到环境水体污染评估或食物毒性检测中。中国科学院华南植物园研究人员利用PacBio三代测序平台对Vqin-Q67进行了全基因组de novo测序。对测序所得的高质量,长读长reads片段使用高度连续的de novo方法拼接,得到了包含两个染色体的0 gap基因组图谱,其中包括蛋白编码基因、非编码RNA基因、转座子位点和基因岛等诸多基因信息。本研究拼接出来的细菌完成图可用作比较基因组辅助进化和物种学研究,也可作为蛋白质编码基因家族分析、不同种弧菌的鱼类致病性分析、非编码RNA和转座子基因进化分析,及Vqin-Q67生物荧光相关基因表达研究的基础。


Liang Gong et al., "Complete genome sequencing of the luminescent bacterium, Vibrio qinghaiensis sp. Q67 using PacBio technology"Scientific data(2018) DOI:10.1038/sdata.2017.205(Imapct factor:4.83)

A. 测序分析策略流程图

B. Circos图:Vqin-Q67细菌1号染色体的COG功能注释
C. 读长长度分布图:三代测序最基本的优势特征就是独特的测序读长,因此足够长的读长是保证三代测序组装质量的基础。可以解决绝大部分重复序列,保证了细菌基因组完成图的质量。




白色念珠菌临床分离株耐药性的演化

真菌基因组重测序

白色念珠菌(Candida albicans)是人体十分常见的共生真菌,存在于正常人口腔、上呼吸道、肠道及阴道中,同时也是机会致病菌,可成为人免疫功能低下时的主要病原体之一,引起皮肤、黏膜、内脏或中枢神经疾病甚至致命。白色念珠菌的耐药性分子机制被认为与麦角甾醇生物合成通路中关键靶酶的变异和高表达相关,导致对唑类抗真菌药不敏感。临床分离株的研究表明存在着多种多样的耐药机制,但仍缺乏具体的遗传和适应性信息。

本研究利用高通量测序技术,对11名口腔念珠菌病患者样本内分离得到的43株白色念珠菌进行重测序和变异分析,并通过单核苷酸多态性(SNPs)、拷贝数变异(CNV)和杂合性缺失(LOH)事件等来评估耐药变异和宿主适应情况。LOH事件与耐药性获得普遍相关,同时发现发生于240个基因的SNPs可能与耐药性和宿主适应型相关。相对地,研究者认为,大多数非整倍体是偶然出现的,并不与耐药性相关联,或可能藉由促进LOH发生关联到耐药性。本研究揭示了白色念珠菌菌株耐药性和宿主适应演化上的全新分子机制,能为后续的候选基因筛选和功能研究奠定基础。


Ford et al., “The evolution of drug resistance in clinical isolates of Candida albicans”Elife(2015)DOI: 10.7554/eLife.00662 (Impact factor:7.75)

A. 永久的和暂时的杂合性缺失图谱,左边代表不同的病人,蓝色代表永久杂合性缺失,红色代表暂时杂合性缺失,绿色代表三倍体型,右边方框代表每个菌株对应的药物最小抑菌浓度(越深色浓度越高)。
B. 不同菌株的非同义替换共现图,五个簇显示簇内所包含的基因突变有共现现象。横坐标代表病人,纵坐标代表基因,白色方框代表正常,绿色代表永久突变,黄色代表驱动突变。

研究趋势与研究热点

在微生物的重测序的应用上,二代测序依然可以展现威力,得到较好的结果。但是在细菌基因组完成图和真菌基因组精细图的绘制上,二代测序片段短、读长短的缺点导致了其应用局限。三代测序技术的基本优势在于长读长,测序序列可直接组装,获得细菌基因组的完成图,或用于组装高质量的真菌基因组精细图,更容易得到菌株基因组的完整信息。在不远的将来,更低成本、更高效率的测序技术,将更广泛地被应用并推动微生物基因组研究。


细菌基因组测序研究趋势

1.突变或不同基因型菌株的比较基因组比较
2.大规模细菌菌株的系统和群体进化研究
3.次级代谢产物的合成和分泌途径研究,预测分泌蛋白与代谢相关基因
4.细菌适应性机制研究,如细菌致病性与抗药性机制研究


真菌基因组测序研究趋势

1.真菌系统发育和进化研究
2.研究真菌的生存机制,包括腐生、共生和寄生等
3.研究次级代谢产物的合成途径,分析药用活性物质及与真菌毒素代谢相关基因

客户常见问题

对于细菌基因组测序,三代和二代测序相比有何优劣势?建议如何选择?
三代测序相比二代,优势在于读长长,受GC含量影响小,可以降低微生物基因组组装难度,提高组装质量。而劣势是测序成本偏高。对于细菌基因组测序,三代测序的长读长可以解决细菌常见的的重复序列问题,也避免了异常GC菌株的测序不均匀问题。由于细菌基因组较小,需要的测序量不大,对于较为精细的细菌完成图来说,三代成本甚至低于二代结合一代的策略。目前为止,在需要组装完整性较低的细菌框架图层面,二代测序仍能保持一定成本优势。随着三代测序通量提升和成本降低,未来三代测序有望在细菌基因组领域获得更广泛的应用。

真菌基因组如何进行编码基因预测?
与原核生物相比,真核生物编码基因结构更为复杂。基因的可变剪切机制,外显子和内含子的结构,使得我们难以用单一软件准确预测真菌的编码基因。为提升真菌基因组编码基因预测的准确性,我们使用了de novo预测、同源预测、EST预测等多种途径进行编码基因预测,并对结果进行整合,尽可能获得可靠的最终注释结果。

真菌基因组如何进行编码基因预测?重测序分析如何保证变异信息的可靠性?
重测序分析中,变异信息是所有后续分析的核心,变异数据的可靠性,是整个研究可靠性的保障。我们在重测序变异检测的过程中,从下机数据的QC,到严格的数据比对,以及变异检测结果的再过滤,每个步骤都经历了严格的质控和数据过滤,保证了最终变异检测数据的可靠性。

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