慢病毒插入位点检测浅析
【2022-08-24】
慢病毒载体系统在细胞治疗中起到了关键的作用，但是其带来的安全性问题不容忽视，可靠的检测方法为后续治疗效果评估提供了保障，本文总结了不同的检测技术特点以及我公司提供的检测服务，供交流学习。
免疫细胞疗法——抗癌利器
免疫细胞疗法是指采集人体自身免疫细胞，经过体外改造、培养，增加其靶向杀伤能力，然后再回输到患者体内，达到消灭肿瘤细胞的目的。一个完整的免疫细胞疗法主要包括外周血PBMC分离、特异性细胞分离与激活、载体递送转染、细胞培养、质控管理、细胞回输及疗效评估和随访跟进七大环节。
免疫细胞治疗流程（CAR-T为例）
病毒载体递送——双刃剑
病毒载体系统的选择，取决于预期的临床适应症、作用机制和给药方法，亦应考虑载体对目标细胞/组织的选择性、转染效率以及转染后治疗序列的功能/活性等。设计病毒载体时，应充分评估载体本身的安全性，并尽可能排除或减少潜在风险因子。
慢病毒为反转录病毒中的一属，用于基因治疗产品其有许多优点，如：1. 可转导目的基因至不分裂细胞内（如淋巴细胞）；2. 适用于体外和体内转导；3. 在细胞内长期表达治疗基因，且转录沉默频率较低，有机会用于慢性疾病的长期治疗。但同时也存在安全性问题，包含慢病毒DNA插入或插入位置邻近的原癌基因/抑癌基因，可能导致肿瘤发生，以及在生产过程中可能产生具有复制能力的慢病毒。
慢病毒载体系统安全性评估——至关重要
慢病毒是目前产业应用比较成熟的病毒载体类型，尤其是在免疫细胞治疗，如CAR-T疗法中起到了关键性的作用。但是其随机插入的不稳定性带来的安全性问题不可忽视。我国在2021年连续出台的四部基因治疗相关产品指导原则：《基因治疗产品非临床研究与评价技术指导原则（试行）》、《基因修饰细胞治疗产品非临床研究技术指导原则（试行）》、《基因治疗产品长期随访临床研究技术指导原则（试行）》、《嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）治疗产品申报上市临床风险管理计划技术指导原则》中都指出评估插入突变（插入位点、插入拷贝数等）引起的遗传毒性风险，鉴定/表征基因组整合位点。
慢病毒插入位点检测技术——归纳整理
慢病毒随机插入的位点评估方法随着基因治疗以及技术方法的发展而发展，主要有以下三种检测技术：
表1 慢病毒随机插入的位点评估方法
目前较为成熟的用于产品检测的慢病毒插入位点检测方法为LM-PCR，其已经应用于多款上市CAR-T产品的安全性评估，如诺华的Kymriah及传奇生物的Carvykti。
阅微基因慢病毒插入位点检测服务——LM-PCR技术
LM-PCR（Linker-Mediated PCR）使用特异性linker与引物，在全基因组层面对插入位点进行全方位精准富集。基因组DNA使用超声随机打断，对打断产物进行末端补平，加A后连接Linker，使用特异性引物进行两轮PCR扩增富集建库后测序分析，对插入位点进行评估。
对此检测技术我司严格按照《中国药典》要求对其准确性、检测限、线性、重现性以及数据量灵敏度做了系统的方法学验证，验证内容及结果如下：
表2 阅微基因慢病毒插入位点检测服务方法学验证内容及结果
项目结果报告内容展示
文末福利
为感谢您在新抗癌技术上贡献出的一份力量，阅微基因特此准备了慢病毒插入位点检测福利大礼包！！！
1. 2022年10月1日前签订检测合同且在2022年12月31日前送样的给予7折优惠。
2. 领取到第一条福利的企业，在2023年持续送样可享85折福利价（如有市场价格调整，以阅微基因解释为准）。
3. 即日起至2023年10月1日止，送样量超过20例的企业直接送方法学验证全套材料图片。
参考文献
1.《基因治疗产品非临床研究与评价技术指导原则（试行）》. 2021年版
2.《基因修饰细胞治疗产品非临床研究技术指导原则（试行）》. 2021年版
3.《基因治疗产品长期随访临床研究技术指导原则》. 2021年版
4.《嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）治疗产品申报上市临床风险管理计划技术指导原则》。2021年版
5.《中国药典》. 2020年版
6. Anna Paruzynski et al. Genome-wide high-throughput integrome analyses by nrLAM-PCR and next-generation sequencing. DOI: 10.1038/nprot.2010.87
7. Wei Wang et al. The LAM-PCR Method to Sequence LV Integration Sites. DOI: 10.1007/978-1-4939-3753-0_9
8. Richard Gabrie et al. Linear Amplification Mediated PCR – Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA. DOI: 10.3791/51543
